Примеры двух генетических мутаций, обнаруженных в лаборатории Бейтлера. Мышь слева демонстрирует мутацию под названием поросенок. Черно-белая мышь справа, известная как далматин, имеет мутацию в гене, известном как Sox10. Этот ген производит белок, который на 98% похож у мышей и людей.
Воротами нашей иммунной системы являются рецепторы, похожие на toll-like (TLR) – крошечные волоски, которые выступают из клеточной мембраны, распознают инородные тела и активируют защитные механизмы организма. Молекулярные строительные блоки TLR присутствуют в бактериях и растениях и считаются одним из самых древних консервативных компонентов иммунной системы. Эти крошечные рецепторы и другие молекулярные мессенджеры также играют большую роль в здоровье человека.
Брюс Бейтлер и его коллеги открыли первый TLR млекопитающих в 1990-х годах, показав, что он распознает бактериальную молекулу, называемую эндотоксином. Бейтлер получил Нобелевскую премию по медицине за это открытие в 2011 году вместе с Жюлем Хоффманном и Ральфом Штайнманом. Но этот платный рецептор не был концом пути.
В последующие годы Бейтлер обнаружил много новых TLR у людей и мышей, а также десятки дополнительных генов, участвующих в нашей врожденной иммунной реакции. Еще многое предстоит открыть.
Долгосрочная цель лаборатории Бейтлера в Юго-западном медицинском центре Техасского университета – выявить ключевые гены, необходимые для противодействия инфекции, – так называемые гены млекопитающих "резистом"- и определить, как эти гены взаимодействуют друг с другом, чтобы защитить тело (или, в случае аутоиммунных заболеваний, настроить организм против самого себя).
На сегодняшний день лаборатория Бейтлера обнаружила 375 трансмиссивных мутаций, которые вызывают заметные изменения у мышей. 253 из этих мутаций были сопоставлены с хромосомами, и в 228 случаях группа обнаружила молекулярную основу мутации. По словам Бейтлера, это лишь верхушка генетического айсберга.
С помощью мощных суперкомпьютерных ресурсов Техасского центра передовых вычислений (TACC) Техасского университета в Остине Бойтлер значительно расширяет и ускоряет свои исследования.
В течение следующих пяти лет он надеется секвенировать экзомы 8000 мышей. (Экзом представляет собой кодирующие части генов, которые синтезируют белки и другие функциональные генные продукты.Эта совокупность геномных данных сформирует наиболее полную базу данных функционально значимых мутаций млекопитающих, доступную науке. Это даст бесценную информацию о сотнях генов, участвующих в пути иммунного ответа и других важных биологических процессах.
Обзор Т-зависимого гуморального иммунного ответа. На диаграмме показаны многие ключевые клетки, участвующие в реакции организма на антигены.
Чтобы достичь этой цели – 8000 мышей, лаборатория Бейтлера будет исследовать 48 экзомов каждую неделю – сканировать, обогащать и секвенировать 500 миллиардов пар оснований и находить точки расхождения с эталонной последовательностью, которая сама по себе состоит из миллионов букв. Проект представляет собой "Большое количество данных" проблема высшего порядка.
"Нам нужна огромная вычислительная мощность, чтобы секвенировать 8000 полных экзомов с помощью мыши," Бейтлер объяснил. "Мы даже не говорили о том, чтобы делать что-то подобное пару лет назад. Но я думаю, что с TACC это действительно возможно."
Джон Фоннер, научный сотрудник группы Life Sciences Computing Group в TACC, охарактеризовал работу Бейтлера как амбициозную и дальновидную, но достижимую благодаря передовым машинам секвенирования и высокопроизводительным вычислениям.
"На анализ этих данных часто уходит десятки тысяч часов процессора в день, не говоря уже о требованиях к хранению данных. Задача исследования отлично подходит для ресурсов TACC," он сказал.
Чтобы изолировать потенциально интересные мутации, лаборатория Бейтлера следует многостороннему протоколу. На первом этапе используются химические мутагены, чтобы вызвать мутации у мышей, чтобы найти гены, участвующие в врожденном иммунитете. Хорошо известно, что мутаген N-этил-N-нитрозомочевина (или ENU) вызывает примерно 60 изменений пар оснований на геном мыши. Но где будут эти изменения и какие последствия они будут иметь, неизвестно.
Чтобы выяснить это, в лаборатории разводят мышей до 3-го поколения для создания гомозиготных особей (имеющих два набора одного и того же гена) по мутациям. Мыши первого и второго поколений могут не передавать мутацию или демонстрировать изменения фенотипа – наблюдаемые признаки, которые демонстрируют мыши. Однако к третьему поколению должно существовать несколько гомозиготных мышей. Это позволяет его группе обнаруживать новый фенотип, даже если признак рецессивен.
Гетерозиготные далматинские животные демонстрируют классическую пегую черно-белую шерсть. У далматинских мышей есть мутация в белке, связанная с некоторыми известными генетическими заболеваниями человека. Мутация происходит в гене Sox10, который продуцирует белок SOX10. У людей мутации в SOX10 связаны с синдромом Ваарденбурга-Шаха, симптомами которого являются глухота, гипопигментация кожи, волос и глаз, а также нарушения пищеварительной системы.
Используя суперкомпьютеры TACC, Бейтлер секвенирует экзомы каждой мыши первого поколения. К тому времени, когда родится мышь третьего поколения (через 6 месяцев после того, как исходная мышь подверглась воздействию мутагена), Бейтлер уже будет знать все мутации, которые она может содержать.
Затем лаборатория Бейтлера изучает иммунный статус каждой мыши третьего поколения с помощью сортировки клеток, активируемой флуоресценцией, проверяя, как мыши реагируют на антигены, заражая животных вирусами, которые обычно безвредны, а также используя несколько других процедур, каждая из которых предназначена для измерения производительность иммунной системы. Когда они находят мышь с иммунной аномалией, исследователи могут обратиться к базе данных мутаций G1, которые они уже приобрели путем секвенирования экзома, чтобы увидеть список мутаций-кандидатов.
Иногда причина отклонения очевидна; иногда это не так. В случаях последнего типа используется метод, известный как мейотическое картирование, для отслеживания причинного дефекта. Это часто связано с мутацией в гене, о котором ранее ничего не было известно. Таким образом, постепенно расшифровывается список всех генов, выполняющих важную функцию в иммунной системе.
Проект продвигает собственные исследования Бейтлера, но также позволяет его лаборатории выступать в качестве банка семян для генетических мутаций.
"Собираемый нами архив будет представлять широкий научный интерес," Бейтлер сказал. "Всякий раз, когда кто-то хочет получить определенную мутацию и хочет ее быстро, они могут просто связаться с нами, и мы можем отправить им соломинку с замороженной спермой в ней, чтобы они могли немедленно регенерировать мышь. Это окажет сильнейшее стимулирующее влияние на биологические исследования."
В настоящее время необходимо подождать до года, чтобы получить мышь с определенной мутацией зародышевой линии.
Молекулярная структура комплекса Toll-подобного рецептора 4. Толл-подобный рецептор 4 (TLR4) образует комплекс с миелоидным фактором дифференцировки 2 (MD-2) и липпополисахаридом (LPS). Комплекс образуется, когда TLR4 встречает молекулы ЛПС на поверхности грамотрицательных бактерий. Распознавание молекулы LPS запускает в клетке реакцию по выработке факторов для борьбы с инфекцией. Молекулярная модель основана на базе данных белков 3FXI и была создана с помощью PyMOL.
По оценкам Бейтлера, путем секвенирования 8000 мышей его лаборатория создаст функционально нулевые аллели в 80 процентах всех генов. Другими словами, Бейтлер выбил 4/5 генов в геноме мыши и определил, какие из них вызывают значительные изменения иммунитета.
Поскольку примерно 80 процентов всех генов мыши имеют человеческий ортолог (то есть они происходят от общего предка), каталог также будет полезен для нашего здоровья.
"Снова и снова мы находим ген, функция которого неизвестна или о котором неизвестно, что он действует в иммунитете, и мы видим, что мутация в этом гене создает очевидный иммунный дефект," Бейтлер сказал. "Если вы сделаете это достаточно много раз, то вскоре у вас появятся сотни генов, которые способствуют иммунному ответу, и вы начнете строить картину молекулярного механизма, который защищает нас от инфекций."
По оценкам Бейтлера, к настоящему времени обнаружено 50 процентов генов, участвующих в иммунитете. В его лаборатории регулярно происходят новые открытия.
Недавно его группа определила факторы транскрипции, называемые Zbtb1, Zeb1 и Nfkbid, которые, как известно, не участвуют в иммунитете, и обнаружила, что другие известные молекулы работают иначе, чем ожидалось.
В качестве примера Бейтлер привел фосфолипид флиппазу, фермент, который перестраивает липиды в плазматической мембране, который, как они обнаружили, необходим для развития B-клеток в костном мозге. "Никто не догадывался, что такой фермент понадобится для этого процесса. Если у мышей нет этой флиппазы, В-клетки не могут там развиваться. И большой вопрос: зачем нужен фермент, который перемещает липиды от внешнего листочка к внутреннему листку мембраны, чтобы В-клетки развивались?? Трудно представить." Развертывание B-клеток – один из основных способов защиты организма от инфекции.
Исследование было опубликовано в выпуске журнала Nature Immunology за ноябрь 2011 г. Группа Бейтлера продолжает изучать последствия находки.
Каждый ген, участвующий в иммунитете, который раскрывает его команда, немного дополняет картину молекулярного механизма. Полное понимание может иметь важные последствия для медицины.
Большая часть лекарств касается воспалений. Даже такие заболевания, как атеросклероз, которые могут привести к сердечным приступам и инсульту, имеют воспалительный компонент.
"В своей работе мы пытаемся понять, как возникает воспаление: с чего оно начинается, как распространяется и, в конечном итоге, как его можно заблокировать? Это те вопросы, на которые мы можем ответить, если у нас есть полное представление об иммунной системе и всех генах, которые для нее необходимы."