Поскольку раньше война с раком велась с помощью хирургических ударов, химического оружия и ядерных бомбардировок, сегодняшние и завтрашние битвы против рака ведутся с помощью информационной войны. В частности, лечение рака крови имеет глубокую историю использования тупых ДНК-алкилирующих агентов, которые без разбора нацеливаются на быстро пролиферирующие белые кровяные тельца, первым из которых был иприт. Возможно, неудивительно, что многие ранние методы лечения рака крови также имели неприятную привычку вызывать их.
Альфред Гилман (обладатель Нобелевской славы по G-протеину) и его коллеги из Йельского университета были одними из первых, кто исследовал сернистые ипритовые газы для правительства с целью их использования в качестве боевых отравляющих веществ. Позже Гилман провел первое клиническое испытание азотистого иприта в 1942 году для лечения лимфомы. Лишь в следующем году, когда корабль Liberty SS John Harvey был атакован в итальянской гавани Бари, в результате чего местные ничего не подозревающие горожане выпустили 100 тонн горчичного газа, химиотерапия стала прочно применяться на карте. Вскрытие трупов выявило, что глубокое повреждение костного мозга глубоко внутри их костей сопровождается чрезвычайно низким уровнем лейкоцитов.
Предыдущие наблюдатели в ту же эпоху также поняли, что выжившие в Хиросиме и Нагасаки, а также многие ничего не подозревающие лучевые терапевты имели повышенную и убедительную тенденцию к развитию острого миелоидного лейкоза (ОМЛ). При ОМЛ происходит быстрое размножение аномальных предшественников клеток крови, которые не могут полностью дифференцироваться в зрелые функциональные клетки крови. По мере старения большинство из нас накапливает пару мутаций в нашем фиксированном хранилище стволовых клеток костного мозга, что приводит к небольшим ограниченным популяциям уникальных генетических вариантов. Этот процесс называется клональным кроветворением. По мере того, как последовательные мутации (а иногда и хромосомные транслокации) постепенно накапливаются в областях генома, критических для роста или дифференцировки клетки, проблемы в конечном итоге материализуются.
Это именно то, что случилось с человеком, которому не повезло, у него были три ужасные мутации клеток крови, дополнительные фрагменты поврежденных хромосом 8 и 21 и явный случай AML. Его борьба и исключительная история болезни недавно были опубликованы в журнале Blood Advances. Хотя этот человек в конечном итоге не выжил, подробности его случая позволяют лучше понять историю жизни многих видов рака и предлагают захватывающий взгляд на невероятные новые инструменты, которые теперь могут полностью отслеживать полную эволюцию болезни за один раз. -ячейковый уровень.
Первыми обнаруженными мутациями были DNMT3-AR882H, RUNX1-D198N и IDH1-R132C. Первый вариант с одним нуклеотидом – один из наиболее распространенных факторов клонального гематопоэза, обнаруживаемых при ОМЛ; он придает устойчивость к большинству химиотерапевтических препаратов и дает мрачный прогноз. DNMT3A – это ДНК-метилтрансфераза, которая добавляет метки метилирования цитозина de novo в промоторные области многих генов для контроля их экспрессии. Это контрастирует с действием так называемых поддерживающих метилтрансфераз, таких как DNMT1, которые дублируют существующие наследуемые метки метилирования с одной цепи на ее партнера.
Вариант фактора транскрипции RUNX1 может быть результатом более чем 50 известных транслокаций хромосом и может быть связан с кариотипом пациента +8, +21. Пациенту были даны два ингибитора топоизомеразы, чтобы нанести вред пролиферирующим клеткам, предотвращая восстановление двухцепочечных разрывов. Вариант IDH1 (изоцитратдегидрогеназа) приводит к перепроизводству гидроксиглутарата и последующему прекращению дифференцировки клеток.
Последний указанный вариант предоставил возможность восстановить нормальную дифференцировку собственных клеток крови путем нацеливания на IDH1 ферментативных ингибиторов. Поэтому пациенту дополнительно давали экспериментальный ингибитор (FT-2102) в рамках клинического исследования. Биопсия костного мозга на этом этапе показала, что небольшая популяция клонов варианта JAK2-V617F была демаскирована. Позже был назначен второй ингибитор IDH1 (ивосидениб); однако на этот раз зарождающаяся субпопуляция JAK2 быстро выросла до клонального доминирования, и впоследствии у пациента развилась истинная полицитемия (ПВ). Это вызвало необходимость введения руксолитиниба, ингибитора JAK2.
Вся клональная архитектура аккуратно выложена на так называемом «рыбном участке» выше. Хотя более сложные рыбные сюжеты иногда больше похожи на произведения искусства из песчаных банок, популярные еще в 1970-х годах, здесь легко понять, как введение ивосидениба привело к взрыву ранее кипящей популяции клонов JAK2. Инструмент, который делает возможным такой детальный анализ, – это одноячеечная мультиомная платформа Tapestri, созданная Mission Bio. В настоящее время Mission Bio – единственная компания, которая может анализировать генотип и фенотип одной и той же клетки одновременно, чтобы нацелить биомаркеры, которые сигнализируют об устойчивости к раку и предсказывают рецидив. Хотя традиционные методы массового секвенирования и проточной цитометрии могут дать некоторые подробности о присутствии биомаркеров, эти методы не могут точно определить размер клона, разнообразие, порядок мутаций или различить, какие мутации происходят в одних и тех же клонах. Они также не могут комбинировать информацию о генотипе с информацией о типе или состоянии клетки, полученной с помощью белковых маркеров.
Платформа Tapestri сочетает экспрессию белка на поверхности клетки с анализом мутаций отдельных клеток для сопоставления соматического генотипа и клональной архитектуры с иммунофенотипом. Этот тип анализа имеет решающее значение для определения основного патогенеза миелоидной трансформации и, следовательно, определения соответствующих мер противодействия прогрессированию заболевания. Например, используя специальную панель из 109 ампликонов, охватывающую 31 из наиболее часто мутируемых генов при миелоидных злокачественных новообразованиях, исследователи обнаружили, что ОМЛ часто представляет собой лишь небольшое количество доминантных клонов, несущих сопутствующие мутации в эпигенетических регуляторах.
Вкратце, рабочий процесс Tapestri начинается с применения антител, помеченных комплементарными олигонуклеотидами, для первоначального выбора желаемых белков-маркеров клеточной поверхности. Волшебство начинается, когда инкапсулированные клеточные лизаты комбинируются с сырьем для ПЦР и уникальными штрих-кодами внутри специальных капельных реакторов. Штрих-коды одновременно кодируют как идентичность клетки (или состояние клетки), так и конкретные SNV и CNV (варианты с одним нуклеотидом и варианты числа копий), связанные с этой клеткой. После этапов амплификации библиотеки ДНК и белков выполняется секвенирование следующего поколения.
В случае, упомянутом выше, ингибирование IDH1 непреднамеренно способствовало преобладанию предполагаемого нижележащего подпорогового клона JAK2. ОМЛ также может включать вторичные мутации IDH1 и даже варианты IDH2, которые восстанавливают избыточное производство гидроксиглутарата и, следовательно, останавливают правильную дифференцировку клеток крови. В сложных случаях поликлонального рецидива, когда несколько вариантов заболевания могут быть независимо и динамически нацелены, Tapestri обеспечивает гораздо более четкое считывание, чем массовое секвенирование следующего поколения для определения правильных клонов. На изображении ниже эксперименты с одной клеткой отслеживают полную клональную эволюцию и клинический рецидив у отдельных пациентов, у которых есть несколько общих дополнительных мутаций драйвера AML, включая NPM1, FLT3-TKD и NRAS.
Линии опухолевых клеток in vitro и сингенные или гуманизированные мышиные модели in vivo стали важными инструментами для понимания рака и создания новых методов лечения. Редактирование гена CRISPR-Cas9 изменило нашу способность генерировать и быстро исследовать роль соматических мутаций в этих моделях. Tapestri превратился в важный инструмент валидации для обнаружения на одной клетке модификаций на и вне мишени при расшифровке эффектов мультиплексных экспериментов по редактированию генов CRISPR. На веб-сайте Mission Bio есть несколько замечаний по применению для оптимизации продуктов для клеточной и генной терапии и тестирования выпуска продукции. У них также есть удобный инструмент дизайна Tapestri Designer для создания пользовательских панелей для использования с платформой Tapestri.