Исследователи из Медицинской школы Стэнфордского университета разработали способ значительно повысить чувствительность метода выявления и секвенирования ДНК раковых клеток, циркулирующих в крови человека.
Надеюсь, что такие "жидкие биопсии" легко получить образцы крови могут однажды заменить необходимость хирургического получения опухолевой ткани для исследования.
Новый подход работает путем выявления ошибок, возникающих при извлечении опухолевой ДНК из крови и подготовке к секвенированию. Удаление этих ошибок из результатов секвенирования позволяет исследователям более точно определять истинные мутации, связанные с раком, даже при очень небольших количествах исходного материала.
"Теперь мы можем еще более чувствительно обнаруживать наличие специфических мутаций в ДНК рака, которые могут помочь выбрать лечение или обнаружить наличие остаточного рака," сказал Максимилиан Дин, доктор медицинских наук, доцент кафедры радиационной онкологии и научный сотрудник факультета CRK. "Мы приближаемся к значительному сокращению необходимости инвазивной биопсии для выявления опухолевых мутаций или отслеживания реакции на терапию."
Дин и Эш Ализаде, доктор медицинских наук, доцент кафедры онкологии, разделяют ведущее авторство статьи, в которой описывается усовершенствованная методика. Он будет опубликован в Интернете 28 марта в журнале Nature Biotechnology. Преподаватель Аарон Ньюман, доктор философии, и бывшие постдокторанты Александр Лавджой, доктор философии, и Дэниел Класс, доктор философии, являются соавторами исследования.
Генетические сообщения в бутылке
Даже при отсутствии лечения раковые клетки непрерывно делятся и умирают. Когда они умирают, они выпускают ДНК в кровоток, как крошечные генетические сообщения в бутылке. Умение читать эти сообщения – и выбирать одно из 1000 – 1 миллиона, которое исходит от раковой клетки – может позволить клиницистам быстро и неинвазивно контролировать наличие и объем опухоли, реакцию пациента на терапию и даже то, как опухоль мутации развиваются со временем под воздействием лечения или другого селективного давления.
Исследователи назвали свой новый двусторонний подход "встроенное подавление цифровых ошибок," или iDES. Он основан на методе под названием CAPP-Seq, который ранее разработали Ализаде, Дин и Ньюман для захвата очень малых количеств опухолевой ДНК из крови путем поиска панели мутаций, которые, как известно, связаны с определенным раком. С помощью CAPP-Seq исследователи смогли обнаружить всего одну молекулу ДНК опухоли в море из более чем 5000 нормальных фрагментов ДНК. Они опубликовали эти результаты в журнале Nature Medicine в 2014 году.
IDES основывается на CAPP-Seq, устраняя неотъемлемое техническое ограничение: неспособность точно секвенировать очень небольшие количества ДНК. Перед попыткой секвенирования необходимо сделать множество копий каждого двухцепочечного фрагмента ДНК. Это копирование известно как амплификация, и вероятность внесения ошибки в последовательность во время амплификации увеличивается с каждым раундом.
Исследователям нужен был способ определить, произошли ли мутации, выявленные в процессе секвенирования, из опухоли или были внесены в процесс секвенирования. Они разработали способ пометить циркулирующие двухцепочечные молекулы ДНК в крови с помощью "штрих-коды" которые уникально маркируют каждую исходную молекулу. Поскольку нити отдельной молекулы ДНК подходят друг к другу, как застежка-молния, можно предсказать последовательность одной цепи по последовательности другой. Таким образом, штрих-коды позволили исследователям сопоставить две нити и найти расхождения. Кроме того, их подход был разработан для минимизации количества молекул, которые теряются во время штрих-кодирования и обработки образцов, что особенно важно при анализе крошечных количеств циркулирующей ДНК, присутствующих у большинства онкологических больных.
‘Значительный прогресс’
"Наша методика является значительным прогрессом по сравнению с предыдущими методами штрих-кодирования, поскольку она устраняет больше ложных срабатываний без ущерба для истинных срабатываний" сказал Ализаде. "Помечая молекулы ДНК, так сказать, на вершине пищевой цепи, мы можем отслеживать, какие молекулы были точно воспроизведены в процессе секвенирования, а какие накопили ошибки, которых не было в опухоли или кровотоке пациента."
Затем они объединили подход штрих-кодирования с другим подходом, который они назвали "полировка фона." "Мы обнаружили, что определенные наборы ошибок секвенирования гораздо чаще возникают в определенных местах в молекулах нашей ДНК, даже у здоровых людей," сказал Ньюман. Он разработал компьютерный алгоритм для сканирования данных и отметки возможных проблемных участков для дальнейшего анализа. Вместе метод молекулярного штрихового кодирования и полировки позволил им отфильтровать распространенные ошибки секвенирования гораздо более эффективно, чем любой метод по отдельности.
Использование iDES увеличивает чувствительность CAPP-Seq для неинвазивного выявления мутаций опухоли в крови примерно в 15 раз. После выявления явных опухолеспецифических мутаций расширенная методика становится еще более точной – обнаружение всего одной или двух последовательностей ДНК опухоли среди 400 000 неопухолевых фрагментов ДНК.
"Мы обнаружили, что наш подход позволяет с высокой точностью, неинвазивно идентифицировать действенные мутации у пациентов с раком легких, и мы надеемся, что этот метод скоро станет клинически доступным," сказал Дин, который отметил, что потребуются дополнительные клинические исследования, чтобы подтвердить, может ли улучшенный iDES CAPP-Seq улучшить исходы у онкологических больных или снизить затраты на здравоохранение. Раковые пациенты, у которых биопсия оказалась неудачной или слишком рискованной, скорее всего, будут одними из первых, кто получит пользу от нового подхода. Кроме того, улучшенный iDES CAPP-Seq также может быть полезен в других медицинских ситуациях. "Эти же типы инструментов можно использовать для обнаружения редких вариантов ДНК, которые могут сигнализировать об отторжении трансплантата и устойчивости к антибиотикам, или помочь в пренатальных диагностических тестах," сказал Ализаде.
Работа команды является примером внимания Стэнфордской медицины к точному здоровью, цель которого – предвидеть и предотвращать заболевания у здоровых, а также точно диагностировать и лечить болезни у больных.