Восстановление рубцовой ткани после сердечного приступа для создания здоровой сердечной мышцы: это изменит правила игры в области кардиологии и регенеративной медицины. В лаборатории ученые показали, что фибробласты (клетки рубцовой ткани) можно превратить в кардиомиоциты (клетки сердечной мышцы), но разобраться в деталях того, как это происходит, было непросто, и использовать такой подход в клиниках или даже другие проекты фундаментальных исследований оказались труднодостижимыми.
Теперь, в новом исследовании, опубликованном сегодня в Nature, исследователи UNC сообщают о прорыве. Они использовали технологию секвенирования одноклеточной РНК в сочетании с математическим моделированием и генетическим и химическим подходами, чтобы очертить пошаговые молекулярные изменения, которые происходят во время преобразования клеточной судьбы из фибробластов в кардиомиоциты. Ученые во главе с Ли Цянем, доктором философии, доцентом кафедры патологии и лабораторной медицины Медицинской школы UNC, не только успешно реконструировали маршруты, по которым одна клетка может пройти в этом процессе, но также определили основные молекулярные пути и ключевые регуляторы, важные для преобразование из одного типа клеток в другой.
"Мы использовали прямое перепрограммирование сердца в качестве примера в этом исследовании," сказал Цянь, старший автор этой статьи и член Кардиологического института им, "Но конвейеры и методы, которые мы здесь установили, могут быть использованы в любом другом процессе перепрограммирования и, возможно, в других несинхронизированных и гетерогенных биологических процессах."
Когда мы младенцы, эмбриональные стволовые клетки по всему нашему телу постепенно превращаются в различные узкоспециализированные типы клеток, такие как нейроны, клетки крови и клетки сердечной мышцы. Долгое время ученые думали, что эти конкретные типы клеток являются терминальными; они не могли снова измениться или вернуться в состояние между эмбриональной и их конечной дифференцированной стадией. Однако недавние открытия показывают, что можно вернуть терминально дифференцированные соматические клетки в плюрипотентное состояние – своего рода "мастер" клетка, которая может самовоспроизводиться и потенциально превращаться в любую клетку в организме. Ученые также выяснили, как преобразовать один тип дифференцированных соматических клеток в другой без обхода стадии плюрипотентности или стадии исходного предшественника. Такие открытия изменили парадигму клеточной иерархии и произвели революцию в исследованиях стволовых клеток и в области регенеративной медицины. Тем не менее, было сложно выяснить, как изучить специфику этих процессов, чтобы использовать их для клинических и фундаментальных исследований.
Прямое перепрограммирование сердца, многообещающий подход к регенерации сердца и моделированию заболеваний, который Qian Lab впервые разработала и оптимизировала за последние несколько лет, включает прямое преобразование сердечных немиоцитов в индуцированные кардиомиоциты (iCMs), которые очень похожи на эндогенные CMs. Как и любой процесс перепрограммирования, многие клетки, которые перепрограммируются, не делают это одновременно.
"Это асинхронный процесс," Цянь сказал. "Конверсии происходят с разной периодичностью. Таким образом, на любом этапе популяция клеток всегда содержит непревращенные, частично перепрограммированные и полностью перепрограммированные клетки. Таким образом, перепрограммирование клеток является «гетерогенным», что затрудняет его изучение с использованием традиционных подходов."
В этом исследовании, используя методы микрожидкостного секвенирования одноклеточной РНК, лаборатория Цяня обратилась к двум основным проблемам «асинхронного» программирования и гетерогенных популяций клеток. Они проанализировали глобальные изменения транскриптома во время преобразования судьбы фибробластов в iCM.
Используя математические алгоритмы, они определили молекулярно различные субпопуляции клеток вдоль конвейера перепрограммирования. Затем они реконструировали маршруты формирования iCM на основе моделирования и экспериментальной проверки. Эти маршруты предоставили им беспрецедентную дорожную карту с высоким разрешением для дальнейших исследований механизмов преобразования клеток.
"Некоторые из того, что мы обнаружили, клинически важны," Цянь сказал, "Например, мы знаем, что после сердечного приступа сердечные фибробласты вокруг поврежденной области немедленно активируются и становятся очень пролиферативными, но эта пролиферативная способность со временем снижается. Как воспользоваться преимуществом различного состояния клеточного цикла фибробластов над прогрессированием сердечного приступа и его последствий, безусловно, расширит применение клеточного репрограммирования для пациентов и оптимизирует результаты."
Цянь добавил, "Мы продемонстрировали пути между пролиферацией клеток и перепрограммированием клеток. Мы также продемонстрировали экспериментальные доказательства того, что изменение состояний клеточного цикла исходных фибробластов может изменить результаты образования новых миоцитов."
Ее команда обнаружила, что молекулярные особенности субпопуляций фибробластов по-разному подавлялись во время репрограммирования, предполагая, что восприимчивость клеток к перепрограммированию варьируется.
Интересно, что эта восприимчивость совпадает со временем дифференцировки кардиомиоцитов во время развития сердца. Признаки в промежуточных популяциях, которые, кажется, появляются раньше в развитии сердца, были более устойчивы к изменениям. Это говорит о том, что недавние эпигенетические воспоминания о клетках легче стереть, и поэтому субпопуляции фибробластов с такими эпигенетическими особенностями легче преобразовать в кардиомиоциты.
"Манипулирование эпигенетическими воспоминаниями – а не просто изменение их текущего эпигенетического статуса – может иметь решающее значение для изменения судьбы клетки с терапевтической точки зрения," Цянь сказал.
При дальнейшем анализе глобальных изменений экспрессии генов во время перепрограммирования исследователи выявили неожиданное подавление факторов, участвующих в процессинге и сплайсинге мРНК.
"Это большой сюрприз для нас," Цянь сказал. "Мы обнаружили, что некоторые из основных клеточных механизмов резко изменились, например, механизмы производства, транспортировки и деградации белков, и, как мы подробно документируем, механизмы сплайсинга мРНК."
Команда продолжила подробный функциональный анализ главного кандидата – фактора сращивания под названием Ptbp1. Данные свидетельствуют о том, что это критический барьер для приобретения специфичных для кардиомиоцитов паттернов сплайсинга в фибробластах. Исследование Цяня показало, что истощение Ptbp1 способствует формированию большего количества iCM.
"Новые знания, полученные в результате наших механистических исследований того, как один фактор сплайсинга регулирует преобразование судьбы фибробластов в кардиомиоциты, действительно являются для нас бонусом," Цянь продолжил. "Без непредвзятого характера этого подхода мы не смогли бы получить такую свежую и ценную информацию о процессе перепрограммирования. И в этом прелесть нашей платформы."
Дополнительный количественный анализ выявил сильную корреляцию между экспрессией каждого фактора репрограммирования и прогрессом отдельных клеток в процессе репрограммирования и привел к открытию новых поверхностных маркеров для обогащения iCM.
Цянь сказал, "Я считаю, что междисциплинарные подходы в этой статье очень эффективны. Они помогли нам идентифицировать ранее нераспознанные функции или механизмы, а также лучше понять природу клетки и прогрессирование заболевания. В конечном итоге этот подход может принести пользу не только пациентам с сердечными заболеваниями, но и пациентам с раком, диабетом, неврологическими заболеваниями и другими состояниями. Мы очень рады предстоящей дороге."