Примерно через четыре месяца после первоначального описания случаев атипичной пневмонии в Ухане, Китай, в декабре 2019 года COVID-19 стал серьезной угрозой пандемии. К 12 апреля 2020 года около половины населения мира находилось в изоляции, из них 1.8 миллионов официально диагностированных случаев. Ученые из Института Пастера, CNRS, Inserm и Université de Paris провели пилотное исследование для оценки надежности нескольких лабораторных тестов с целью лучшего понимания профиля реакции антител на SARS-CoV-2 и того, как вирус распространяется среди населения.
Были разработаны и оценены четыре теста на обнаружение антител SARS-CoV-2, а также два теста на обнаружение нейтрализующих антител. Эти тесты, известные как лабораторные анализы, являются первым этапом эпидемиологических исследований COVID-19. Результаты этого исследования были опубликованы в Интернете на medRxiv 24 апреля 2020 г., а затем в Science Translational Medicine 17 августа 2020 г.
Оценка распространенности бессимптомных и симптоматических случаев инфекции SARS-CoV-2 и их профиля реакции антител является жизненно важной частью усилий по сдерживанию вспышки и пролить свет на то, как распространяется вирус.
ПЦР-тесты в настоящее время широко используются во Франции и во всем мире, в том числе в Институте Пастера (Национальный справочный центр респираторных вирусов, далее именуемый CNR), для диагностики COVID-19, а также для обнаружения и количественного определения РНК SARS-CoV-2. Эти вирусологические тесты необходимы для выявления и мониторинга людей с активной инфекцией.
Также используется ряд серологических анализов. Есть два типа:
Важность надежных тестов
Надежность этих тестов имеет решающее значение. Поэтому несколько команд из Института Пастера, CNRS, Inserm и Université de Paris приступили к разработке серологических анализов, проведя пилотное исследование для оценки надежности четырех анализов обнаружения путем измерения уровней антител к SARS-CoV-2. Они также разработали два новых метода обнаружения, что дало им дополнительную точку сравнения. Группы образцов крови были взяты у разных категорий лиц. Эти группы, используемые для оценки анализов, можно разбить следующим образом:
Результаты серопревалентности
Серопозитивность (наличие антител) была обнаружена у 32% лиц с легкими признаками, совместимыми с COVID-19, за 15 дней до взятия проб и у 3% бессимптомных доноров крови.
Время ответа антител
Ученые определили время ответа антител у госпитализированных лиц с COVID-19. Антитела появились через 5-6 дней после первых симптомов, с нейтрализующей активностью через 7-14 дней.
Эта временная шкала, вероятно, длиннее у лиц с умеренными симптомами или бессимптомных лиц, а титры (концентрация) антител, вероятно, ниже.
Описание и оценка анализов
Исследовательские группы разработали четыре лабораторных теста для оценки уровня антител SARS-CoV-2 в сыворотке крови человека.
Анализы ELISA: два анализа ELISA представляют собой обычные анализы, основанные на полноразмерном N-белке SARS-CoV-2 (ELISA N) или внеклеточном домене вирусного спайкового белка (S).
Преимущества: эти анализы основаны на методе, который легко переносится и используется в коммерческих наборах. Анализ ELISA S был немного более чувствительным, чем анализ ELISA N.
Для обоих анализов был поднят вопрос о том, как их можно использовать в больших масштабах или вывести на рынок, поскольку в настоящее время они являются собственными испытаниями. Анализы, основанные на аналогичном принципе, уже поступили в продажу и в настоящее время проходят оценку CNR.
Эффективность коммерческих анализов оценивается CNR с использованием образцов сыворотки, определенных как отрицательные или положительные на антитела против SARS-CoV-2 на основании как минимум двух серологических анализов, разработанных в Институте Пастера.
Анализ S-Flow: этот анализ обнаруживает спайковый белок SARS-CoV-2 в его естественной конформации на поверхности клетки. Он очень чувствителен и специфичен. Результаты были аналогичны ELISA S, с более высокой чувствительностью для низких уровней антител. Но для анализа требуется специальное оборудование (проточный цитометр), которое менее широко доступно, чем считыватели планшетов, обычно используемые в медицинских лабораториях. Это делает его более подходящим для использования в эпидемиологических исследованиях, а не в крупномасштабных диагностических исследованиях.
Анализ LIPS: это "иммунопреципитация" В этом тесте используется метод, отличный от других тестов, и он определяет связывание антител с белками SARS-CoV-2 N или S или их субдоменами. Тест обеспечивает подробное профилирование участков вирусного белка, на которые направлен ответ антител. Поэтому в анализе используются различные "целевые антигены," и чувствительность теста варьируется в зависимости от обнаруженного антигена. Для этого исследования были использованы часть N и часть S (S1). Этот анализ также может быть использован в его нынешней форме для большинства животных.
Исследовательские группы также разработали два теста для обнаружения нейтрализующих антител в образцах сыворотки инфицированных людей: один с использованием инфекционного вируса SARS-CoV-2 и требует доступа в лабораторию BSL3, а другой – на основе "псевдовирус" который может использоваться без необходимости в оборудовании BSL3.
Анализ нейтрализации инфекционного SARS-CoV-2 сложнее реализовать, поскольку с вирусом нужно обращаться в лаборатории BSL3. Он использует фиксированную дозу вируса, которая уничтожает 100% клеток. После смешивания его с разными разведениями сыворотки ученые наблюдают, достаточно ли присутствия антител против SARS-CoV-2 для нейтрализации вируса и подавления размножения вируса, тем самым предотвращая разрушение клеток.
Исследовательские группы также разработали тест нейтрализации, известный как Lenti S, на основе неинфекционного псевдовируса вместо вируса SARS-CoV-2. Этот анализ не требует помещения в лабораторию биобезопасности, что упрощает его реализацию в больших масштабах.
В отличие от анализов типа ELISA, которые выявляют антитела, анализ нейтрализации измеряет способность антител блокировать проникновение вируса в клетки. Таким образом, он может определить, есть ли у человека антитела, способные ограничивать размножение вируса и способные обеспечить защиту от дальнейшей инфекции SARS-CoV-2. Исследовательские группы стремятся адаптировать этот анализ, чтобы его можно было использовать для высокопроизводительного тестирования. Потребуются дальнейшие исследования, чтобы определить количество нейтрализующих антител, которые могут обеспечить защиту, и их устойчивость с течением времени.
Корреляция между анализами
Чтобы оценить сравнительную надежность анализов, исследовательские группы сравнили их с использованием трех когорт.
У госпитализированных пациентов такое же количество положительных случаев было получено с помощью серологических анализов, основанных на N и S; Диагностическое применение анализа для обнаружения антител против S1 было менее чувствительным, цель последнего заключалась в исследовании корреляции с защитой.
В когорте пациентов с симптомами из Уаза тесты S-Flow и ELISA S и комбинация LIPS N + S1 дали очень похожие результаты и более высокие уровни обнаружения, чем с другими тестами. У доноров крови положительные случаи были обнаружены только с помощью анализов S-Flow и ELISA S.
В заключение:
1. Исследовательские группы сравнили эффективность четырех тестов на обнаружение антител к SARS-CoV-2. В целом они работали очень хорошо, с различиями в чувствительности в зависимости от теста и особенно от целевых антигенов.
2. Что касается анализов обнаружения нейтрализующих антител, то анализ нейтрализации псевдовирусов прост и надежен, но для него требуются помещения для культивирования клеток и специальное оборудование. Серологические анализы используются для оценки уровня связывания антител с вирусом, а не для прогнозирования их функциональности.
3. В настоящее время ученые устанавливают корреляции, чтобы оценить, какие образцы крови обладают нейтрализующей способностью, исходя из уровней связывания антител с различными частями вируса.
4. Присутствие нейтрализующих антител в крови может указывать на защиту от дальнейшей инфекции, особенно если титр высок, но это еще не было официально продемонстрировано.
5. Серологические тесты могут быть использованы в эпидемиологических исследованиях для определения серологической распространенности среди определенных групп.
6. В группе первых случаев в Уазе наблюдалась значительная циркуляция вируса: у 32% людей с умеренными клиническими признаками, совместимыми с COVID-19, были антитела.
7. Результаты тестов, проведенных на бессимптомных лицах, зависели от исследуемых групп и их местонахождения. Например, из 200 тестов, проведенных у бессимптомных доноров крови в Уазе (люди, у которых появились недавние признаки, не могут сдавать кровь), 3% были положительными.
"Эти анализы используются для выявления распространенности серы в эпидемиологических исследованиях, а также для диагностики людей. Они также очень полезны для полной характеристики панелей сыворотки при оценке коммерческих тестов. В этом исследовании участвовали несколько команд из Института Пастера, работавших в сотрудничестве с врачами и вирусологами из Парижской сети государственных больниц (AP-HP) и Inserm, эпидемиологами и Французской службой крови (EFS). Мы хотели бы думать, что пациенты и добровольцы, сдавшие кровь для этого исследования,," подчеркивают соавторы исследования Марк Элоит, Хьюго Муке, Оливье Шварц и Сильви ван дер Верф.
"Анализы ELISA N и ELISA S представляют особый интерес в текущем контексте. В Институте Пастера каждую неделю можно было проводить тысячи тестов, а методику можно было использовать в других лабораториях," объясняет Сильви ван дер Верф, руководитель Национального справочного центра респираторных вирусов и последний автор исследования.
"Анализы типа LIPS имеют ту же чувствительность, что и анализы типа ELISA для того же антигена, и полезны для детального изучения вероятности защиты от дальнейшей инфекции в когортах из нескольких тысяч образцов сыворотки, чтобы определить, какие антигены оптимальны для высокопроизводительного тестирования. подход, который будет иметь решающее значение для смягчения мер изоляции. После этой работы мы также расширили использование теста LIPS на обнаружение инфекции сезонными коронавирусами и их роль в защите или облегчении в отношении инфекции SARS-CoV-2," говорит Марк Элоит, руководитель лаборатории обнаружения патогенов и последний автор исследования.
"С начала исследования в марте 2020 года анализ S-Flow использовался для изучения степени гуморального ответа у пациентов с ПЦР + с легкими симптомами. В настоящее время мы оцениваем продолжительность этого ответа. Мы анализируем образцы выздоравливающих людей, собранные в разные моменты времени после появления симптомов" говорит Оливье Шварц, глава отдела вирусов & Подразделение иммунитета и совместный последний автор исследования.